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复合酶酶解羽毛粉的条件及效果研究

发布时间:2020年5月22日 来源:www.sdyumaofen.com 返回列表

羽毛中的粗蛋白含量在80%以上,各种氨基酸总量在70%以上,是一种营养价值很高的饲料蛋白来源,但是这种蛋白需要经过分解才能吸收应用,本课题研究一种复合酶对羽毛粉进行酶解的工艺条件,分析了酶解上清液中多肽和氨基酸的组成,并对未处理的羽毛粉、酶解上清液及酶解残渣进行氨基酸含量的测定。

1 材料与方法

1.1 材料

鸭毛、复合酶液、凝胶柱、缓冲液,所用试剂均为分析纯。

1.2 仪器

BIOF微生物玻璃发酵罐、高效液相色谱仪、高速离心机、可见紫外分光光度计、恒温气浴摇床、PH计、电热恒温水槽

1.3 实验方法

1.3.1 羽毛样品的制备

鸭毛经冲洗、干燥、粉碎即成羽毛粉。

1.3.2 酶液添加量试验

复合酶液的酶活测定为300U/mL;羽毛粉润湿后121℃处理60min,60℃烘干过夜;称取5g烘干鸭羽毛粉,分别添加10、20、30、40、50、60、70mL复合酶液,再添加自来水至总体积100mL,充分润湿羽毛,40℃反应48h,取样测定反应液中可溶性蛋白含量。

1.3.3 酶解时间试验

200g羽毛粉用自来水润湿,121℃处理60min,添加复合酶液800mL(450U/mL),再添加自来水至总体积3000mL,40℃反应68h,按时间取样测定反应液中可溶性蛋白含量。

1.3.4 酶解上清液的理化分析

根据确定的酶液添加量和酶解时间酶解200g羽毛粉,离心取上清液,4℃保存待用;取适量4℃保存的酶解上清液于4℃,10000r/min离心10min,经0.22μm微孔滤膜过滤后,取10μL直接上样SuperdexTMPeptide10/300GL色谱柱,以含0.25mol/LNaCl的0.01mol/L,pH8.3PBS缓冲液为洗脱液,流速为0.25mL/min,检测波长为228nm,根据酶解液组分分布曲线,收集各峰组分,-20℃保存备用。

1.3.5 水溶性蛋白含量的测定

采用Folin-酚试剂法(Lowry法)测蛋白含量,以牛血清白蛋白为标准蛋白,测定波长为700nm,计算水溶性蛋白含量(mg/mL)及酶解率(%),绘制曲线,计算蛋白含量和酶解率。

1.3.6 羽毛氨基酸组成的测定

采用Waters公司的ACCQ-Tag①的方法对未处理羽毛粉、酶解上清液及酶解残渣进行氨基酸含量的分析。

1.3.7 体外消化率的测定

根据GB/T17811-19999,采用胃蛋白酶盐酸溶液进行体外消化率测定。

2 结果与分析

2.1 蛋白质含量标准曲线

蛋白质含量标准见图1。

图1 蛋白质含量标准曲线

2.2 酶液添加量试验

在一定的时间和温度的条件下,以不同浓度的复合酶液对羽毛粉酶解,结果见图2。从图2可以看出,当添加30~40mL复合酶液时,酶解液中可溶性蛋白含量较高,其酶解率达到21%~23%,随着复合酶液继续添加,酶解率上升缓慢,因此在酶解羽毛粉制备可溶性蛋白液过程中,复合酶液的最适添加量为6~8mL处理1g羽毛粉(即1800~2400U复合酶液处理1g羽毛粉)。

图2 酶液添加量试验

2.3 酶解时间实验

在一定的浓度和温度条件下测定酶解过程中不同时间酶解液中的可溶性蛋白含量,结果见图3。从图3可以看出,经28~32h酶解,溶液中可溶性蛋白含量较高,其酶解率达到52%~55%,随着酶解时间的增加,酶解率上升缓慢,因此在酶解羽毛粉制备可溶性蛋白液过程中,酶解的最适时间为28~32h。

图3 酶解羽毛粉时间试验

2.4 酶解上清液组成分析

酶解上清液采用SuperdexTMPeptide10/300GL色谱柱进行分离,结果见图4。并计算图中各峰面积占总峰面积的比例,结果见表1。

将图4的色谱图与SuperPeptide10/300GL标准图谱比较可以得知,酶解上清液中的组分分子量基本都在6kDa以下。各峰面积占总峰面积的百分比见表1,其中6号峰为氨基酸,其峰面积占总峰面积的4。374%;1号至五号峰为多肽,多肽的峰面积占总峰面积的95。254%;多肽与氨基酸占到总峰面积的99%以上。这说明鸭毛角蛋白经过复合酶液的酶解成为多种可溶的多肽与氨基酸,大分子量的蛋白已不存在。

表1 各色谱峰峰面积比

2.5 羽毛粉与酶解液残渣的理化分析

对试验中所用的鸭毛进行成份分析,结果见表2。从表2可以看出鸭毛的粗蛋白含量高达87%,粗蛋白与水分的含量占鸭毛的99%。经离心分离得到的酶解残渣中可溶性蛋白含量占17。96%,粗蛋白含量大于80%,胃酶消化率也大于80%。将酶解残渣与进口鱼粉进行氨基酸组成、粗蛋白含量及胃酶消化率的比较,结果见表3。 

表2 鸭毛分成分析

由表3可以看出酶解残渣中组氨酸、赖氨酸及蛋氨酸含量较低,这与文献报道的羽毛粉氨基酸组成不平衡,组氨酸、赖氨酸及蛋氨酸含量较低一致。除了上述3种氨基酸外,天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、丙氨酸4种氨基酸含量与进口鱼粉的含量一致,其余10种氨基酸的含量均远高于进口鱼粉,并且粗蛋白含量与胃酶消化率也高于进口鱼粉。因此,酶解残渣可烘干粉碎制成优质羽毛粉,并可以代替饲料添加剂中的鱼粉。

表3 酶解残渣与进口鱼粉的比较

通过本文实验得出以下几点总结:

1)采用高温处理法与复合酶酶解法相结合的方式对羽毛粉进行降解的适宜工艺条件为:羽毛粉经121℃高温处理60min后,以每克羽毛添加1800~2400U的复合酶浓度,在40℃条件下酶解32h,酶解率达到55%,具有较好的酶解效果。

2)通过对酶解上清液进行分析表明,其中绝大部分为分子量在6kDa以下的多肽和氨基酸,可分别被加工成高品质的氨基酸产品与多肽产品。

3)酶解残渣中富含17种氨基酸,粗蛋白含量大于80%,胃酶消化率也大于80%。其粗蛋白含量与胃酶消化率均高于进口鱼粉,因此酶解残渣可制成优质羽毛粉,替代饲料添加剂中的鱼粉。所以对酶解残渣进一步利用,可作为一种直接的,高品质的动物饲料蛋白源。