摘 要： 禽类羽毛主要由角蛋白质构成，性质极其稳定，在水、盐酸及稀盐酸溶液中完全不溶解，属于不溶性蛋白。由于羽毛的多肽链间存在着很多的二硫键和氢键，使羽毛蛋白质的结构特别稳定，如果不经处理，动物消化道中的消化酶基本上无法把它们消化分解。羽毛中约含粗蛋白质80%～85%，硫氨基酸含量居所有天然饲料之首，缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸的含量均居前列，如果加工方法得当，是调配这几种必需氨基酸的好原料。将产碱性蛋白酶的细菌接种培养，得到目标产物碱性蛋白，用其降解羽毛粉，得到小分子蛋白，可以促进吸收，更好地利用羽毛粉，又能保护环境，减少污染。

蛋白酶是催化蛋白质水解的一类酶，是酶学研究中较早也是最深入的一种酶。到21世纪初，已经报道的微生物蛋白酶预计超过900种，是一种重要的工业化应用酶制剂。本试验利用大连海域高产碱性蛋白酶的菌株，优化其发酵条件，探究其降解羽毛粉的能力，实现海洋菌工业应用价值。

1 试验材料

1.1 菌种来源

实验室贮存的大连海域产碱性蛋白酶芽孢杆菌DL12。

1.2 试验试剂

蛋白胨、酵母粉、酸水解酪蛋白，北京奥博星生物技术有限责任公司；琼脂，日本进口分装；其余试剂均采用国产分析纯。

1.3 斜面保藏培养基（LB)

蛋白胨1%，酵母抽提物0.5%,NaCl 1%，琼脂1%,pH值7.0。

1.4 液体发酵培养基

酪蛋白酸水解物（干酪素）1%，葡萄糖1.5%,KH₂PO₄0.1%,Mg SO₄·7H₂O 0.02%,Ca Cl₂·2H₂O 0.01%,p H值7.0。

1.5 实验仪器

电热恒温培养箱HPX-9052MBE，恒温振荡培养箱HNY-100B，高压灭菌锅MLS₃0₂0，高速冷冻离心机CF15RX，超净工作台SWCJ-1FD。

2 试验方法

2.1 微生物的富集培养

将产碱性蛋白酶的细菌接种到固体培养基上活化，34℃培养48h，将活化后的菌种接种到液体发酵培养基中，340rmp，摇床培养48h。

2.2 粗酶液的提取

取摇床培养48h左右的发酵液200mL，在4℃下8000r/min离心20min，取上清液，得粗酶液。

2.3 羽毛粉的降解

温度组：将等量的羽毛粉分装在7个10ml离心管内，1号管加入8mL 0.2%碱溶液，其余分别加入8mL粗酶液；后取3～8号管，置于20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃下，所有样品反应30min；另取2号离心管，加入8mL粗酶液。取0.25mL装入1mL离心管内，并装入等体积的5倍样品缓冲液。沸水加热3～5min后上样。pH组：将等量的羽毛粉分装在8个10mL离心管内，1号管加入8mL0.2%碱溶液，其余分别加入8m L粗酶液；后取3～9号管，调节其pH分别为6、7、8、9、10、11、12，所有样品反应30min；另取2号离心管，加入8mL粗酶液。取0.25ml装入1mL离心管内，并装入等体积的5倍样品缓冲液。沸水加热3～5min后上样。

2.4 电泳

运用SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳法对所制备的样品分离，用考马斯亮蓝染色液染色，考马斯亮蓝脱色液脱色，得到试验结果。

3 结果与分析

3.1 温度组

对电泳之后所得到的胶板反复脱色后，可以看到酶解羽毛粉温度组的电泳条带的酶解成果。通过肉眼观察胶板可以看出，温度组从20℃开始，随着温度的升高，酶解效果逐渐增强，在40℃时酶解效果最佳，在70℃时温度过高，电泳条带开始模糊。

3.2 pH组

pH组从pH值7.0开始，随着pH值的升高，酶解效果逐渐增强，在pH值11.0时酶解效果最佳，在pH值12.0时碱性过强，电泳条带开始模糊。

温度组电泳图

pH值酶解电泳图

4 结论

综上，可以在温度为40℃，pH值11.0的条件下降解羽毛粉，得到最容易吸收的产品。