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探究海洋菌产碱性蛋白酶降解羽毛粉实现海洋菌工业应用价值

发布时间:2020年2月28日 来源:www.sdyumaofen.com 返回列表

摘 要: 禽类羽毛主要由角蛋白质构成,性质极其稳定,在水、盐酸及稀盐酸溶液中完全不溶解,属于不溶性蛋白。由于羽毛的多肽链间存在着很多的二硫键和氢键,使羽毛蛋白质的结构特别稳定,如果不经处理,动物消化道中的消化酶基本上无法把它们消化分解。羽毛中约含粗蛋白质80%~85%,硫氨基酸含量居所有天然饲料之首,缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸的含量均居前列,如果加工方法得当,是调配这几种必需氨基酸的好原料。将产碱性蛋白酶的细菌接种培养,得到目标产物碱性蛋白,用其降解羽毛粉,得到小分子蛋白,可以促进吸收,更好地利用羽毛粉,又能保护环境,减少污染。

蛋白酶是催化蛋白质水解的一类酶,是酶学研究中较早也是最深入的一种酶。到21世纪初,已经报道的微生物蛋白酶预计超过900种,是一种重要的工业化应用酶制剂。本试验利用大连海域高产碱性蛋白酶的菌株,优化其发酵条件,探究其降解羽毛粉的能力,实现海洋菌工业应用价值。

1 试验材料

1.1 菌种来源

实验室贮存的大连海域产碱性蛋白酶芽孢杆菌DL12。

1.2 试验试剂

蛋白胨、酵母粉、酸水解酪蛋白,北京奥博星生物技术有限责任公司;琼脂,日本进口分装;其余试剂均采用国产分析纯。

1.3 斜面保藏培养基(LB)

蛋白胨1%,酵母抽提物0.5%,NaCl 1%,琼脂1%,pH值7.0。

1.4 液体发酵培养基

酪蛋白酸水解物(干酪素)1%,葡萄糖1.5%,KH2PO40.1%,Mg SO4·7H2O 0.02%,Ca Cl2·2H2O 0.01%,p H值7.0。

1.5 实验仪器

电热恒温培养箱HPX-9052MBE,恒温振荡培养箱HNY-100B,高压灭菌锅MLS3020,高速冷冻离心机CF15RX,超净工作台SWCJ-1FD。

2 试验方法

2.1 微生物的富集培养

将产碱性蛋白酶的细菌接种到固体培养基上活化,34℃培养48h,将活化后的菌种接种到液体发酵培养基中,340rmp,摇床培养48h。

2.2 粗酶液的提取

取摇床培养48h左右的发酵液200mL,在4℃下8000r/min离心20min,取上清液,得粗酶液。

2.3 羽毛粉的降解

温度组:将等量的羽毛粉分装在7个10ml离心管内,1号管加入8mL 0.2%碱溶液,其余分别加入8mL粗酶液;后取3~8号管,置于20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃下,所有样品反应30min;另取2号离心管,加入8mL粗酶液。取0.25mL装入1mL离心管内,并装入等体积的5倍样品缓冲液。沸水加热3~5min后上样。pH组:将等量的羽毛粉分装在8个10mL离心管内,1号管加入8mL0.2%碱溶液,其余分别加入8m L粗酶液;后取3~9号管,调节其pH分别为6、7、8、9、10、11、12,所有样品反应30min;另取2号离心管,加入8mL粗酶液。取0.25ml装入1mL离心管内,并装入等体积的5倍样品缓冲液。沸水加热3~5min后上样。

2.4 电泳

运用SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳法对所制备的样品分离,用考马斯亮蓝染色液染色,考马斯亮蓝脱色液脱色,得到试验结果。

3 结果与分析

3.1 温度组

对电泳之后所得到的胶板反复脱色后,可以看到酶解羽毛粉温度组的电泳条带的酶解成果。通过肉眼观察胶板可以看出,温度组从20℃开始,随着温度的升高,酶解效果逐渐增强,在40℃时酶解效果最佳,在70℃时温度过高,电泳条带开始模糊。

3.2 pH组

pH组从pH值7.0开始,随着pH值的升高,酶解效果逐渐增强,在pH值11.0时酶解效果最佳,在pH值12.0时碱性过强,电泳条带开始模糊。

温度组电泳图


pH值酶解电泳图

4 结论

综上,可以在温度为40℃,pH值11.0的条件下降解羽毛粉,得到最容易吸收的产品。