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碱性蛋白酶芽孢杆菌降解羽毛粉的能力探讨

发布时间:2020年2月24日 来源:www.sdyumaofen.com 返回列表

我国羽毛资源丰富,每年有几十万吨,羽毛中的蛋白含量高达80%以上,但是这些蛋白属于角蛋白,不容易被动物消化吸收,需要经过蛋白酶降解,才可应用于畜禽的喂养中,蛋白酶是种重要的工业化应用酶制剂,主要用于催化蛋白质水解,到21世纪初,已经报道的微生物蛋白酶预计超过900种。本试验利用大连海域高产碱性蛋白酶的菌株,优化其发酵条件,探究其降解羽毛粉的能力,实现海洋菌工业应用价值。

1试验材料

1.1菌种来源实验室贮存的大连海域产碱性蛋白酶芽孢杆菌DL12。

1.2试验试剂蛋白胨、酵母粉、酸水解酪蛋白;琼脂,日本进口分装;其余试剂均采用国产分析纯。

1.3斜面保藏培养基(LB)蛋白胨1%,酵母抽提物0.5%,NaCl1%,琼脂1%,pH值7.0。

1.4液体发酵培养基酪蛋白酸水解物(干酪素)1%,葡萄糖1.5%,KH2PO40.1%,MgSO4·7H2O0.02%,CaCl2·2H2O0.01%,pH值7.0。

1.5实验仪器电热恒温培养箱HPX-9052MBE,恒温振荡培养箱HNY-100B,高压灭菌锅MLS3020,高速冷冻离心机CF15RX,超净工作台SWCJ-1FD。

2试验方法

2.1微生物的富集培养将产碱性蛋白酶的细菌接种到固体培养基上活化,34℃培养48h,将活化后的菌种接种到液体发酵培养基中,340rmp,摇床培养48h。

2.2粗酶液的提取取摇床培养48h左右的发酵液200mL,在4℃下8000r/min离心20min,取上清液,得粗酶液。

2.3羽毛粉的降解温度组:将等量的羽毛粉分装在7个10ml离心管内,1号管加入8mL0.2%碱溶液,其余分别加入8mL粗酶液;后取3~8号管,置于20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃下,所有样品反应30min;另取2号离心管,加入8mL粗酶液。取0.25mL装入1mL离心管内,并装入等体积的5倍样品缓冲液。沸水加热3~5min后上样。pH组:将等量的羽毛粉分装在8个10mL离心管内,1号管加入8mL0.2%碱溶液,其余分别加入8mL粗酶液;后取3~9号管,调节其pH分别为6、7、8、9、10、11、12,所有样品反应30min;另取2号离心管,加入8mL粗酶液。取0.25ml装入1mL离心管内,并装入等体积的5倍样品缓冲液。沸水加热3~5min后上样。

2.4电泳运用SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳法对所制备的样品分离,用考马斯亮蓝染色液染色,考马斯亮蓝脱色液脱色,得到试验结果。

3结果与分析

3.1温度组对电泳之后所得到的胶板反复脱色后,可以看到酶解羽毛粉温度组的电泳条带的酶解成果。通过肉眼观察胶板可以看出,温度组从20℃开始,随着温度的升高,酶解效果逐渐增强,在40℃时酶解效果最佳,在70℃时温度过高,电泳条带开始模糊。

3.2pH组pH组从pH值7.0开始,随着pH值的升高,酶解效果逐渐增强,在pH值11.0时酶解效果最佳,在pH值12.0时碱性过强,电泳条带开始模糊。

图1 温度组电泳图图2 PH值酶解电泳图

本实验表明,可以在温度为40℃,pH值11.0的条件下降解羽毛粉,得到最容易吸收的产品。